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编者按
不同类器官需要不同的助长环境，尤其是培养基中的助长因子，需要悉心调配，详情使用的助长因子种类与浓度。那么，哪些类器官需要哪些助长因子呢？该何如详情使用哪些助长因子呢？
今天，咱们尽头转头一项于2022年发表在《Cell Stem Cell》的征询——《Optimized human intestinal organoid model reveals interleukin-22-dependency of paneth cell formation》，该征询通过走访白细胞介素（IL）-22这一因子对类器官助长的作用，优化了东谈主类小肠类器官（hSIO）的培养枢纽，揭示了IL-22不径直纳尾肠谈干细胞的再生材干，而是会增多潘氏细胞数目以及促进肠谈抗菌肽（AMP）的抒发。
一、 征询配景
白细胞介素（IL）-22由免疫细胞产生，主要作用于上皮细胞，可视为免疫系统和抒发IL-22共受体复合物的寥落组织细胞之间的主要交流渠谈。IL-22与肠谈生理的多个方面联系，它被以为是粘膜愈合的伏击驱能源。一项重要征询（主要基于小鼠类器官现实）提倡，IL-22通过径直增多肠谈干细胞（ISCs）的数目和增殖活性来促进组织再生[1]。
但是，最近的小鼠征询标明，IL-22 通过指点过渡增殖细胞 （TA） 的增殖来促进再生，同期扼制 ISC 扩增以至指点 ISC 细胞凋一火[2]。IL-22已被平素评估为炎症性肠病（IBD）的潜在调整枢纽[3]。因为据报谈，IL-22 可通过促进杯状细胞分化和指点粘卵白分泌，增强肠谈樊篱对病原体防护[4]、促进抗菌卵白（AMP）[5]和补体因子[6]的产生。
IL-22在IBD中的作用仍未完全进展。在临床前小鼠模子中，阻断IL-22的产生或与受体的蚁合可改善肠谈炎症[7]。与之相悖的不雅点是，IL-22或IL-22受体的零落导致结肠炎恶化，而用IL-22-Fc交融卵白调整改善了野生型小鼠的炎症[8]。此外，在IBD患者中，不雅察到樊篱功能断绝和疾病进展的握续症状与IBD患者的IL-22水平升高联系[9]，标明IL-22在IBD中的致病作用。但是，另一项征询揭示IL-22在IBD患者中具有保护作用[10]。
小肠类器官（SIO）提供了一种体外模子，用于征询在莫得其他要素的情况下生物调换剂对原代上皮细胞的径直影响[11]。天然东谈主小肠类器官（hSIO）的培养条目已有报谈[12]，但是东谈主类肠谈组织的细胞类型万般性和三维 （3D） 结构尚未完全详细。值得平安的是，潘氏细胞可产生肠谈AMPs（如溶菌酶和驻防素），这在调换宿主驻防方面至关伏击[13]。但东谈主肠谈中潘氏细胞的分化经过尚未详情。因此本文中，征询者建立了一个优化的hSIO培养决策，探伤了IL-22对东谈主小肠上皮中万般上皮细胞类型的指点作用以及基因抒发的径直影响。
二、 征询收尾
1、优化的东谈主小肠类器官培养枢纽本征询
基于经典征询中的传统培养枢纽[14]，开导了一套“两步法”hSIO培养决策，与传统扩增培养基比拟，本征询优化后的第一步培养基（称为“模式化培养基”）中去除了扼制剂SB202190、前线腺素E2和烟酰胺，又添加了扼制剂CHIR99021和IL-22；第二步培养基（称为“进修化培养基”）在第一步的基础上裁减了外源WNT信号。本征询的模式化培养基最先hSIO向分泌谱系分化。
模式化14天后，将模式化培养基替换为进修化培养基，以相沿具有平素隐窝状出芽结构的类器官扩增。这么培养得到的hSIO中，潘氏细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞分布于所有这个词类器官结构中。用免疫组织化学象征物染色和透射电子显微镜的方法学表征证据了这些分泌细胞类型的进修。
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原文图1. 具有多分化材干的hSIO的培养
为了对这种hSIO的细胞万般性进行充分了解，征询东谈主员对进修的hSIO（在IL-22存鄙人助长了14天）进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析。本征询的数据拿获了1283个细胞，这些细胞采集成10个群体，包括ISC、TA的两个亚簇、早期和晚期肠细胞（enterocytes，肠谈招揽型上皮细胞）、分泌型祖细胞、杯状细胞、潘氏细胞、肠内分泌细胞（EEC）和簇细胞。
图2. IL-22调控hSIO的细胞万般性
2、IL-22并不会促进肠谈再生
在培养基中添加IL-22，并不会影响ISC的全齐数目，天然ISC的相对比例增多了，但却减少了活细胞的总和，同期显耀裁减了类器官酿成的恶果。此外，在培养基中添加IL-22减少了类器官出芽并增多了细胞逝世，标明IL-22在hSIO的永恒培养中起到了无益作用。
总的来说，IL-22既不增强ISC的扩增，也不增强hSIO的助长。scRNA-seq收尾标明，IL-22裁减了（早期）enterocytes助长比例。为了证据这一不雅察收尾，苍井空种子征询东谈主员检测了ANPEP和CYP3A4基因（仅抒发于enterocytes），收尾显现，IL-22如实扼制了enterocytes揣摸基因如ANPEP和CYP3A4。
图3. IL-22扼制hSIO的助长
3、IL-22指点东谈主潘氏细胞分化
用去除IL-22的进修化培养基培养得回的hSIO中险些不存在潘氏细胞，标明IL-22起到促进潘氏细胞分化的作用。而用含有IL-22的进修化培养基培养hSIO，潘氏细胞在一周内出现，而再次去除IL-22会导致潘氏细胞在两周内消散，稳当潘氏细胞的寿命周期。
类器官中杯状细胞和EEC的百分比不受IL-22的影响，标明IL-22特异性指点潘氏细胞分化，而不是最先举座分泌谱系。hSIO不错每周传代一次，并在莫得IL-22的进修化培养基中扩增>12个月，之后潘氏细胞仍然不错被IL-22灵验地指点。这种可逆施展将IL-22信号传导详情为潘氏细胞稳态的重要介质。
为了探伤潘氏细胞的发源，本征询进行了基于图像的及时谱系追踪，发现新指点的潘氏细胞均着手于MUC2+祖细胞，相沿潘氏细胞和杯状细胞分享共同分泌祖细胞群体的不雅点。
图4. IL-22指点东谈主潘氏细胞分化
4、IL10RB敲除导致hSIO中的潘氏细胞零落
IL-22受体基因 IL10RB的突变导致疏远的遗传性 IBD。本征询创建了两个IL10RB功能丧失的突变基因W159∗和 W204∗。本征询标明，佩带这两种突变基因中的任何一种的hSIO，即使用含有IL-22的进修化培养基培养后，亦然零落潘氏细胞的，而杯状细胞和EEC不受影响。
图5. IL10RB是IL-22指点的潘氏细胞分化所必需的
5、PI3K/AKT/mTOR通路介导IL-22卑鄙的东谈主潘氏细胞分化
为赫然解 IL-22指点的潘氏细胞分化的机制，征询东谈主员通过小分子扼制剂检测了 IL-22卑鄙信号传导阶梯 STAT3和 PI3K/AKT/ mTOR。与未惩处的类器官比拟，在用含有IL-22进修化培养基培养的hSIO中，通过BP-1-102阻断STAT3活化对 DEFA5阳性潘氏细胞的比例莫得影响。
相悖，PI3K扼制剂LY294002或 AKT扼制剂MK-2206显耀裁减了潘氏细胞的存活率。更值得平安的是，扼制mTOR险些完全阻断了IL-22指点的潘氏细胞分化。PI3K，AKT 或 mTOR 扼制剂以剂量依赖性神志裁减了潘氏细胞存活率，而杯状细胞存活率莫得显耀转变。这些收尾标明 PI3K/AKT/mTOR 信号通路特异性地最先潘氏细胞分化而不影响其他分泌谱系。
本征询进一步在四种不同条目下对进修培养基培养的类器官进行定量卵白质组分析：-IL-22，+IL-22，+IL-22与STAT3扼制剂BP-1-102共用，+IL-22与mTOR 扼制剂雷帕霉素共用。IL-22显耀上调了几种潘氏细胞卵白，包括DEFA5，DEFA6，Reg3A和ITLN2，但在扼制mTOR时，这些卵白质的增多显耀被挽回。这些卵白质组学数据揭示了mTOR介导IL-22促进潘氏细胞分化的进一步根据。
图6. PI3K-mTOR信号传导介导IL-22卑鄙的潘氏细胞分化
6、IL-22指点的AMP抒发不仅限于潘氏细胞
除了一些潘氏细胞特异性基因（举例DEFA6和ITLN2）外，前50个IL-22上调的基因在所有细胞类型中均有抒发。这些基因包括AMP（Reg1A、Reg1B和DMBT1）、补体因子（如CFI）和粘卵白（如MUC1）。
事实上，IL-22共同受体IL10RB 和 IL22RA 在 hSIO 中由所有上皮细胞类型抒发。在24小时内通过 IL-22刺激显耀指点这些基因（如Reg1A、Reg1B 和 DMBT1）的抒发。这些AMP基因的抒发不是由与潘氏细胞分化交流的信号传导阶梯最先的，因为与潘氏细胞象征不同，这些基因的抒发不受雷帕霉素惩处的影响。在东谈主小肠切片上Reg1A/B和DMBT1的组织学分析显现，它们在隐窝的下半部分抒发最高，并不仅限于潘氏细胞。
总的来说，这些数据标明IL-22可能动作隐窝底部宿主驻防的生态位因子，其中 IL-22不仅指点潘氏细胞分化，而且指点肠干细胞颠倒子代中AMPs 的抒发。
图7. IL-22指点宿主驻防基因抒发
三、 编者点评
本征询形色了hSIO优化培养系统的建立，况兼通过辩论IL-22对指点东谈主小肠上皮的万般上皮细胞的径直影响，标明优化的培养条目显耀改善了东谈主肠上皮的离体建模，并显耀拓宽了东谈主肠谈类器官的愚弄；详情了IL-22在通过PI3K/AKT/mTOR通路指点东谈主潘氏细胞分化中起到伏击作用。本征询将IL-22详情为在高Wnt信号环境中体外优化hSIO中潘氏细胞酿成的指点剂，但不可解说IL-22是体内潘氏细胞酿成的必需指点剂。
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参考文件
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